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江西省养猪行业协会 发布时间:2019-07-30 阅读:

摘要 以真核质粒pcDNA3.1-flag-nsp1α为模板,利用PCR扩增出nsp1α基因片段,构建原核重组载体pET32a-nsp1α,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态,1 mmol/L IPTG在37  ℃诱导表达6 h,成功获得以包涵体形式存在的重组蛋白,能够与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体复性后作为抗原免疫新西兰大白兔,3次免疫后20 d获得兔多抗血清。通过间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光、免疫组化等试验获得了高效价的兔多抗血清,该血清能够特异性地识别真核质粒表达的nsp1α以及PRRSV BJ4株。该试验成功表达了pET32a-nsp1α重组蛋白,并制备了高效价、高特异性的兔抗nsp1α多克隆抗体。

关键词 PRRSV;nsp1α;多克隆抗体

中图分类号 S 852.65+1  文献标识码 A

文章编号 0517-6611(2019)12-0115-05

doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.031

开放科学(资源服务)标识码(OSID):

Abstract Using eukaryotic plasmid pcDNA3.1flagnsp1α as a template,nsp1α gene fragment was amplified by PCR.The prokaryotic recombinant vector pET32ansp1α was constructed and transformed the pET32ansp1α into receptor state of Escherichia coli cells BL21 (DE3) to express the nsp1α by adding 1 mmol/L IPTG at 37 ℃.The recombinant protein nsp1α was obtained in the form of inclusion body ,which could react with His tag monoclonal antibody.The inclusion bodies after renaturation was used as antigen to immunize New Zealand white rabbit,rabbit polyclonal antiserum was obtained on the 20th day after three times of immunization.The results of  indirect ELISA,Western blot,indirect immunofluorescence,immunohistochemistry showed that the rabbit polyclonal antibody with high titer were obtained,which could specifically identify nsp1α expressed by eukaryotic plasmid and BJ4 strains of PRRSV.The recombinant protein pET32ansp1α was successfully expressed,highspecificity rabbit antinsp1α polyclonal antibody with high tier was prepared.

Key words PRRSV;nsp1α;Polyclonal antibody

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)能够引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),也称“蓝耳病”,其主要特征是母猪严重的繁殖障碍以及仔猪出现呼吸困难。该病自1987年在美国报道以来,已经蔓延至全球主要的养猪国家,是造成养猪业重大经济损失的主要疫病之一[1-2]。1996年郭宝清等[3]

从流产的猪胎儿中分离出PRRSV病毒,证实了我国也存在猪繁殖与呼吸综合征。2006年我国南方暴发由变异的PRRSV引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征,混合感染其他病原(如猪圆环病毒、猪链球菌、猪肺支原体等),造成了巨大的经济损失[4-5]。因此,研究PRRSV的致病机理,建立有针对性的防控措施对于养猪业的发展意义重大。

PRRSV基因组编码非结构蛋白的开放阅读框约占基因组全长的80%,首先翻译为包含所有非结构蛋白的多聚蛋白前体,nsp1α具有类木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶活性,能够自我切割,从多聚蛋白上分离出来[6];同时,它还能抑制干扰素,对PRRSV逃逸宿主免疫机制具有重要的作用[7]。目前市场上尚无商品化的nsp1α抗体,笔者利用原核表达系统制备nsp1α的重组蛋白,免疫动物后获得抗nsp1α的多克隆抗体,可以用于检测PRRSV的感染情况,也为nsp1α的进一步研究提供了有用的试验材料。

1 材料与方法

1.1 质粒和毒株

真核质粒pcDNA3.1-flag-nsp1α、pcDNA3.1-flag、原核质粒pET32a由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存;PRRSV BJ-4株由中国农业大学杨汉春教授惠赠。

1.2 主要试剂

Ex Taq酶、核酸胶回收试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、pMD18T载体、T4连接酶、大肠桿菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞均购自TaKaRa公司;质粒回收试剂盒购自杭州爱思进生物公司;IPTG和氨苄霉素购自索莱宝生物公司;小鼠抗His标签IgG购自Proteintech公司;小鼠抗flag标签IgG、HRP-羊抗兔IgG、FITC-羊抗兔IgG均购自Abbkine公司;AEC酶底物试剂盒购自北京中杉金桥生物公司;Lipofectamaine2000购自Invitrogen生物试剂公司;其他常规试剂为国产分析纯试剂。